Stargardt 病（STGD1）是一种由 ABCA4 基因的双等位基因变异引起的遗传性黄斑变性疾病。ABCA4 基因编码一种定位在光感受器外段的转运蛋白，负责清除视觉循环中的有毒副产物。目前已发现超过 1,200 种 STGD1 致病性变异，其中约 10% 是隐藏在基因深处的“深内含子（deep-intronic, DI）突变”——它们会让细胞在读取基因时错误插入多余的“伪外显子”，导致生成的蛋白质无法正常工作或被提前降解。目前，在研的反义寡核苷酸疗法需要为每个突变单独设计序列，适用范围很小。因此，开发一种纠正不同位点突变引起的剪接缺陷的通用疗法具有重要意义。

近日，荷兰内梅亨大学医学中心和乌特勒支大学药物科学研究所的科研团队在 Molecular Therapy – Nucleic Acids 杂志上联合发表了一项突破性研究。他们利用 CRISPR-Cas9 基因编辑系统，结合两组导向 RNA（gRNA），分别靶向 ABCA4 基因中两个高频 DI 变异区域（内含子 30 和 36），并通过脂肽 C18:1-LAH5 实现 Cas9 核糖核蛋白（Cas9 ribonucleoproteins, Cas9 RNP）的高效递送。该策略不仅能精准切除错误插入的基因片段，还能保留正常蛋白功能。该策略在视网膜前体细胞中的成功应用，为开发通用型基因疗法奠定了基础。这项突破不仅为 Stargardt 病患者带来新希望，也为其他遗传病的治疗开辟了新思路。

一、RPNCs 综合表征
研究者分别设计了靶向 ABCA4 基因内含子 30 和 36 的 gRNA，并选择了油酸修饰的 LAH5 多肽（即脂肽 C18:1-LAH5）作为递送载体。C18:1-LAH5 与 Cas9 RNP 孵育后形成纳米复合物（ribonucleoprotein nanocomplexes, RPNCs），通过动态光散射（DLS）监测 RPNC 的形成。结果显示，随着 Cas9 RNP: 脂肽比例提高，RPNCs 的粒径减小，平均粒径在 151-191 nm 之间；随着脂肽浓度的增加，RPNCs 的 Zeta 电位逐步升高（图 1A），此外，电泳迁移率转移试验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）显示（图 1B），RPNCs 的迁移率随着脂肽浓度的增加显著降低，在 GFP-Cas9:ATTO550-gRNA:ATTO647-gRNA:脂肽=1:1:1:50 的比例下即可合成 RPNCs 稳定产物。综上结果表明，脂肽 C18:1-LAH5 能够与 Cas9 RNP 高效结合，形成稳定的纳米复合物。

图1. RNP 和 C18:1-LAH5 脂肽不同比例下合成的 RPNCs 表征

利用 NanoFCM 在单颗粒水平对 RPNCs 进行综合表征，检测参数包括颗粒粒径、浓度和包封率等多个维度。结果显示，与不含 C18:1-LAH5 脂肽的样品相比，Cas9 RNP 与 C18:1-LAH5 脂肽形成 RPNCs 后（无论是单个 gRNA 还是两个 gRNA 的组合）中位直径和荧光阳性颗粒的浓度均显著增加（图 2A-D）；此外，RPNCs 在单颗粒水平两种 gRNA 双阳的比例高达 84%，比不含脂肽的样品比例高出 70 倍（图 2E-F）。综上表明，C18:1-LAH5 脂肽能够有效促进复合物形成 RPNCs，而不含 C18:1-LAH5 脂肽的样本中荧光颗粒很可能是 Cas9 RNP  的聚集物。
 

图2. NanoFCM 对 RPNCs 的综合表征

二、细胞摄取效率
为了观察细胞对 RPNCs 的摄取，在 HeLa 细胞中加入 RPNCs，并在分别培养 2、4、12、24 小时后进行荧光共聚焦成像。结果显示，随培养时间的延长，GFP-Cas9、ATTO550-gRNA1和ATTO647-gRNA2 的荧光信号均逐步增强，表明 HeLa 细胞能同时摄取 RPNCs 中的 Cas9 和两种 gRNA（图 3）。
 

图3. 共聚焦荧光显微镜下细胞摄取 RPNCs

三、基因编辑效率
明确了细胞对 RPNCs 的有效摄取后，为了验证 RPNCs 模型的基因编辑能力，研究者们选用了 HEK293T stoplight 和 eGFP HEPA 两种荧光报告细胞系对 RPNCs 的编辑效率进行评估。首先在 HEK293T stoplight 细胞系中分别使用脂肽 C18:1-LAH5 和 LAH5 修饰的 RPNCs 进行 eGFP 的插入，如图 4A、B 所示，脂肽 C18:1-LAH5 的组别中 eGFP 的表达量显著高于 LAH5；而后在 eGFP HEPA 细胞中进行 eGFP 敲除，如图 4C、D 所示，脂肽 C18:1-LAH5 的组别敲除比例显著高于 LAH5，且随浓度升高而升高。综上表明 RPNCs 能够有效地对目标片段进行插入和敲除，而脂肽 C18:1-LAH5 的递送效率显著高于 LAH5，且 RNP 与脂肽比例为 1:250 时均呈现较高的编辑效率。

图4. 两种荧光报告细胞系中 RPNCs 的基因编辑效率

在明确 RPNCs 的最优合成比例、递送条件后，研究者们在 HeLa 细胞、患者来源的成纤维细胞、诱导多能干细胞衍生的光感受器前体细胞（PPCs）等不同来源细胞系中进行了细胞摄取实验，探究了 RPNCs 的基因编辑效率，例如在成纤维细胞模型中，针对内含子 30，gRNAs（30 1+2）在对照组和 STGD1 患者组中均实现了部分内含子移除，编辑效率均在 75% 左右，显著高于 gRNAs（30 3+4）（图 5A）。针对内含子 36，两对 gRNA（gRNAs 36 1+2和gRNAs 36 1+3）都能诱导部分缺失，效率均为 40% 左右（图 5B）。此外，研究者们还在基因组水平、RNA 水平和蛋白质水平对 RPNCs 的基因剪切、剪切后修复等方面进行了研究，证明了脂肽 C18:1-LAH5 修饰的 RPNCs 在不同细胞模型中均表现出优秀的基因编辑效率，为 STGD1 的治疗提供了有力支持。

图5. 成纤维细胞中 RPNCs 的基因编辑效率

研究意义
该研究提出了一种基于脂肽介导 CRISPR-Cas9 递送的通用基因编辑策略，能够纠正 ABCA4 基因中由 DI 突变引起的剪接缺陷。这种方法不仅适用于特定突变，还可以同时纠正多个突变，为 STGD1 的治疗提供了一种潜在的通用解决方案。此外，脂肽递送还为非病毒递送系统在基因编辑中的应用提供了新的思路和方法，推动了基因编辑技术在眼科领域的应用。

展望
NanoFCM 能在单颗粒水平对纳米级颗粒的物理化学性质（如粒径、荧光强度等）进行综合表征。在基因编辑领域，NanoFCM 可用于表征 RPNCs 的粒径分布、包封效率、荧光强度等多维信息，这有助于深入理解 RPNCs 的理化性质，为递送系统的研发和优化提供有力支持。展望未来，随着基因编辑技术的持续发展，对载体质量、荷载效率等关键指标的检测势必会成为常规要求，NanoFCM 有望成为基因编辑载体质量控制和稳定性评估等指标的关键表征工具，为临床科研和产业化提供便捷且精准的检测方式，推动新型治疗技术的发展！