数据非依赖采集（DIA）可通过划分采集窗口，将所有检测范围内的离子进行碎裂和扫描，定量准确性高、重现性好、蛋白质组覆盖深度广，尤其适合低丰度肽段的检测。但现有DIA数据分析方法主要依赖谱图库或直接数据库搜索，但两者均受限于数据库中的已知肽段列表，难以发现由遗传变异或突变产生的新生肽段。2025年5月30日，Bioinformatics Solutions Inc.发表了最新预印本文章 ^[1]，介绍了一种直接从复杂的DIA谱图中发现低丰度突变肽段的算法，同时严格控制FDR。

DIAVariants工作流程
如图1所示，读取数据后，首先进行MS1特征峰提取，以识别电离肽段产生的具有明确同位素的可靠MS1信号响应。接下来进行PEAKS DIA数据库搜索，将谱图与参考蛋白质序列库比对，筛选FDR小于1%的可信肽段，并基于保留时间和母离子 m/z与MS1特征峰关联。
对数据库匹配不可信的MS1特征峰，利用DIA de novo预测与关联MS2最佳匹配的肽段序列。然后通过SPIDER算法，基于de novo预测的序列、MS1特征峰信息和参考序列校正测序错误。SPIDER候选肽段中，仅保留包含1-2个突变位点的序列，下一步预测这些候选突变肽的索引保留时间(iRT)，通过RT回归模型转换为实验RT，过滤掉预测iRT与实测RT差异显著的突变肽段。最后，将候选突变肽与数据库搜索得到的肽段合并构建临时谱图库，基于实测RT进行PEAKS DIA谱图库搜索，通过Q值控制FDR。

图1 DIAVariant方法流程

结果展示
PEAKS DIA直接数据库搜索性能
下载两个公开质谱数据集（PXD046453、PXD050030），采用相同的database和参数，分别使用PEAKS DIA DB search和DIANN2.1进行分析，结果如表1所示，从定量蛋白数量、CV指标来看，两者在DIA蛋白质组数据的定量性能上，稳定性和灵敏度均较高。
表1 文献数据分析结果对比
跨物种搜索验证DIAVariants特异性
在ABRF人类样本（搜索小鼠数据库）和MSV000095360小鼠样本(搜索人类数据库)的结果中，DIAVariant报告的肽段变体中85%以上可在本物种数据库中被可信鉴定(q-value <0.01)，验证了算法的高特异性(表2)。 表2 跨物种检索结果
与蛋白基因组方法对比
Fierro-Monti等 ^[2]曾对Hela细胞样本进行外显子组测序，通过蛋白基因组的方法构建了233个经典蛋白变体，将其加入人类参考序列数据库后，使用DIANN 1.8.1检索到了相应的DIA数据，并通过同位素合成肽段和靶向验证，最终报告了6个肽段变体。我们下载了文献中的原始数据，用DIAVariants直接分析，结果成功鉴定到了上述6条肽段变体的其中2条(LEQDLQQIQAK 和 NELSGALTGLIR)(表 3)，并且额外发现426个低丰度潜在多肽变体。这些低丰度肽段因MS1信号弱，难以通过DDA数据检测，更加显示了DIA-MS在低丰度肽段检测中的优势。
表3 DIAVariants与蛋白基因组报道肽段对比。 小结
DIAVariant通过整合DIA数据库搜索、从头测序和同源校正，提供了一种高效、无偏的DIA数据突变肽段识别方法，可同时检测参考数据库内的已知肽段和数据库外的肽段变体，尤其适用于低丰度肽段和复杂遗传变异的分析。该方法为蛋白质组学中序列变体的发现提供了新工具，有望推动精准医学和癌症新抗原研究的发展。但目前仅验证了1-2个氨基酸突变位点，未涉及插入和缺失的情况，未来算法仍会继续扩展。

参考文献
[1] Qiao, R., et al. (2025). "De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery." doi: https://doi.org/10.1101/2025.05.30.657054.
[2] Fierro-Monti, Ivo, et al. "Assessment of Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry (DIA-MS) for the Identification of Single Amino Acid Variants." Proteomes 12.4 (2024): 33.
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.05.30.657054v1

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