细胞谱系追踪技术通常是指使用各种手段对某类祖细胞亚群进行标记，在后续时间点对其分化命运进行检测，它对于揭开多样的、基础的生物学过程中的分子机制是非常关键，因此一直以来建立能够在体内进行追踪细胞谱系的动物模型是生物学研究的一个长期目标。

根据重组类型和数量，基因重组系统可以分为传统的单重组酶介导的遗传方法与更复杂的单重组酶介导的多色报告系统方法和多重组酶介导的遗传方法，本期鼠博士为大家讲解单重组酶介导的多色报告系统。

上期推文：【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式

单重组酶介导的单色报告基因就是最基础的使用Cre-loxp系统进行谱系示踪，该技术的关键在于评估驱动Cre的启动子的表达位置。而Cre-loxP系统的多色报告基因可用于单细胞标记和克隆分析，为单细胞增殖、分化后的命运提供了有价值的信息。这种报告系统也被称之为“BrAInbow”系统。
 

在 Brainbow 系统中，Cre/lox重组可在三种或更多荧光蛋白（XFP）之间随机选择表达，从而提供了一种区分相邻神经元和可视化其他细胞相互作用的方法。根据lox 位点不同还可以分为Brainbow-1 与Brainbow-2。

Brainbow-1
Brainbow-1是在报告基因之间加入成对的不同的 lox 位点，通过 Cre 介导的切除实现不同的基因重组。

lox位点是一个34bp的序列，由两个13bp的反向回文重复序列和8bp的中间间隔序列组成：ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。N表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野生型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等。在Cre酶的作用下，Lox变体不会与经典 loxP发生重组，但可以与相同的Lox变体发生重组。

利用这一特性，Brainbow-1通过在同一结构中交替使用变异 lox 位点和经典 loxP位点，cre酶会在任意一对相同的lox位点之间进行切除，同时去除另一对位点中的一个，从而防止进一步的重组。  

案例1
当无Cre酶表达时：

1 该系统按照启动子的方向，表达红色荧光RFP。RFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现红色。

当Cre酶表达时，该系统会出现两种可能发生的情况：
1 序列中存在两个同向的loxP位点（图中黑色三角形），Cre酶会切除两个loxP位点之间的序列（红色荧光RFP序列被切除）。之后，该系统按照启动子的方向，表达黄色荧光YFP。YFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现黄色。

2 序列中存在两个同向的lox2272位点（图中斜条纹三角形），Cre酶会切除两个lox2272位点之间的序列（红色荧光RFP序列与黄色荧光YFP序列被切除）。之后，该系统按照启动子的方向，表达蓝色荧光M-CFP，因而细胞呈现蓝色。

因此，细胞可能存在三种颜色：红色（cre未表达）；黄色、蓝色（cre表达）

案例2
当无Cre酶表达时：

1 该系统按照启动子的方向，表达橙色荧光OFP。OFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现橙色。

当Cre酶表达时，该系统会出现三种可能发生的情况：

1 序列中存在两个同向的loxN位点（图中斑点色三角形），Cre酶会切除两个loxN位点之间的序列（橙色荧光OFP序列被切除）。之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光M-RFP。M-RFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现红色。

2 序列中存在两个同向的lox2272位点（图中斜条纹三角形），Cre酶会切除两个lox2272位点之间的序列（橙色荧光OFP序列与红色荧光M-RFP序列被切除）。之后，该系统按照启动子的方向，表达黄色荧光M-YFP，M-YFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现黄色。

3 序列中存在两个同向的loxP位点（图中黑色三角形），Cre酶会切除两个loxP位点之间的序列（橙色荧光OFP序列、红色荧光M-RFP序列与黄色荧光M-YFP序列被切除）。之后，该系统按照启动子的方向，表达蓝色荧光M-CFP，因而细胞呈现蓝色。

因此，细胞可能存在三种颜色：橙色（cre未表达）；红色、黄色、蓝色（cre表达）。

Brainbow-2
在 Brainbow-2 中，存在一对或多对的相反方向的loxP 位点，这些相反的方向loxP 位点分隔多个报告基因的序列。

当两个loxP为反向时，Cre 可以倒转中间的报告基因的序列，从而产生多个重组结果。只要重组酶存在，倒转就可以持续。而通过限制cre酶的活性时间，就可以实现细胞中基因的稳定重组。

案例1
当无Cre酶表达时：

1  该系统按照启动子的方向，表达红色荧光RFP。RFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现红色。

当Cre酶表达时，序列中存在一对反向的loxP位点（图中黑色三角形），Cre 可以倒转两个loxP位点之间的序列，该系统会出现两种可能发生的情况：

1  倒转发生奇数次。该系统按照启动子的方向，表达蓝色荧光M-CFP。M-CFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现蓝色。

2  倒转发生偶数次。该系统按照启动子的方向，表达红色荧光RFP。RFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现红色。

因此，细胞可能存在两种颜色：红色（cre未表达）；红色、蓝色（cre表达）。
案例2

当无Cre酶表达时：

1 该系统按照启动子的方向，表达绿色荧光nGFP。nGFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现绿色。

当Cre酶表达时，该系统会出现四种可能发生的情况：

a. LoxP位点①与③为同向，Cre酶切除①与③位点之间的序列（绿色荧光nGFP序列与黄色荧光YFP序列被切除），并介导反向的loxP位点③与④之间进行倒转：

1 倒转发生奇数次。该系统按照启动子的方向，表达蓝色荧光M-CFP。M-CFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现蓝色。

2 倒转发生偶数次。该系统按照启动子的方向，表达红色荧光RFP。RFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现红色。

b. loxP位点②与④为同向，Cre酶切除②与④位点之间的序列（红色荧光RFP序列与蓝色荧光M-CFP序列被切除），并介导反向的loxP位点①与②之间进行倒转：

3 倒转发生偶数次。该系统按照启动子的方向，表达绿色荧光nGFP。nGFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现绿色。

4 倒转发生奇数次。该系统按照启动子的方向，表达黄色荧光YFP。YFP序列后的Poly A（图示为pA）会介导基因停止表达，后续的元件均不表达，因而细胞呈现黄色。

因此，细胞可能存在四种颜色：绿色（cre未表达）；蓝色、红色、绿色、蓝色（cre表达）。

使用 Brainbow系统对小鼠特定组织的单细胞进行标记后，即可根据颜色对终点细胞进行分组，从而实现单细胞水平的谱系谱系示踪。

上述单重组酶报告基因系统只能依赖一个Maker来定位我们的目的细胞，但随着细胞分类的不断深入，我们往往需要两个甚至两个以上的Maker才能准确定位我们想要研究的细胞群体，这时标记细胞就需要使用到多重组酶介导的遗传方法，下一期鼠博士为大家讲解多重组酶介导的多色报告系统。

Reference：
[1] Livet, J., Weissman, T., Kang, H. et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature 450, 56–62 (2007). https://doi.org/10.1038/nature06293

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