结直肠癌（CRC）是全球发病率第三、癌症死亡率第二的癌症，手术、放疗和化疗是其主要治疗方法，但放化疗的非特异性细胞毒性常导致显著副作用。近年来，新抗原在癌症免疫治疗中显示出关键作用，其特异性T细胞的功能和数量影响免疫检查点阻断疗法的疗效，新抗原疫苗和T细胞输注也表现出良好效果。新抗原是肿瘤中由基因突变产生的免疫肽，通过人类白细胞抗原（HLA）呈递，具有免疫原性并可激活T细胞介导的靶细胞杀伤。此外，CRC肿瘤中存在大量细菌，其来源的肽在多患者中被检测到并具有免疫原性。然而，目前关于CRC免疫肽组的研究较少，明确鉴定的表位有限，且肿瘤内细菌对免疫肽组的影响尚不清楚。     今天为大家分享一篇2024年6月发表在Pharmacological Research上的文章，文章的题目是“Proteogenomic analysis identifies neoantigens and bacterial peptides as immunotherapy targets in colorectal cancer”。作者采用了一种包括全外显子测序（WES）、16S核糖体DNA（rDNA）测序和免疫肽组学在内的蛋白质基因组学策略，系统地分析了CRC组织的免疫肽组，并鉴定了一系列免疫原性新抗原和细菌表位。单细胞TCR测序获得了表位反应性T细胞的高频TCRαβ序列，TCRαβ的转导可以赋予T细胞识别呈递表位的靶细胞的能力，为CRC免疫治疗提供了潜在的靶点。   实验方法 本研究从8名结直肠癌患者中收集肿瘤组织和正常组织样本，并从患者血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。通过全外显子测序（WES）分析肿瘤组织和PBMCs的DNA，以检测基因突变；利用16S核糖体DNA（rDNA）测序分析肿瘤组织中的细菌组成。采用免疫肽组学方法，从肿瘤组织中提取HLA-I结合的肽段，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，以鉴定新抗原和细菌肽。通过质谱数据分析软件对鉴定的肽段进行分析，并结合WES结果建立个性化的新抗原数据库。此外，通过ELISpot实验和流式细胞术评估候选肽段的免疫原性，并利用单细胞TCR测序分析表位反应性T细胞的TCR库。最后，构建TCR-T细胞，并评估其对特定表位的反应性，以验证这些靶点在免疫治疗中的潜力。 实验结果
1. 结直肠癌免疫肽组的深入分析 使用 PEAKS X Pro 软件对8个结直肠癌原发肿瘤和6个正常组织样本的免疫肽组进行了全面分析，共鉴定出74679个HLA-I结合肽段，其中23915个为结直肠癌特异性免疫肽。这些肽段主要为9-11个氨基酸长度，与整体免疫肽组特征一致。作者通过WES获得了每位患者的HLA-I分型信息，使用NetMHCPan4.1在线分析每个样品中的肽亲和力。预测平均81.3%的肽HLA-I结合。通过与正常组织的比较，发现肿瘤和正常组织之间有47.1%的免疫肽是共享的。   图1. CRC免疫肽组分析 2. 来自癌症睾丸抗原（CTAs）的表位 CTA由过表达并广泛存在于肿瘤中的抗原组成，包括癌胚抗原和各种癌症睾丸抗原蛋白，许多CTA表位已被确定为抗肿瘤靶点。作者利用276个已知的CTAs列表在样本中搜索CTA肽段，发现大多数CTAs在肿瘤和正常组织中均能产生免疫肽。作者绘制了每个样品中鉴定的CTAs肽的热图，结果显示大多数CTA在肿瘤和正常组织中都产生免疫肽，通过比较，最终在6个肿瘤样本中鉴定出23个来自15个CTAs的结直肠癌特异性免疫肽，其中2个被证实具有免疫原性。   图2.鉴定CTA表位 表1. CTA抗原表位鉴定 3. 结合测序数据鉴定新生抗原和细菌肽 作者为每位患者构建了包含突变蛋白的个性化数据库，最终在3个结直肠癌样本中鉴定出4个新抗原。通过16S rDNA测序分析了4对结直肠癌样本中的肿瘤内细菌组成，构建了个性化的细菌数据库（细菌丰度>0.5%），并将其与人类蛋白质组数据相结合，以鉴定肿瘤细胞上呈现的细菌肽。该分析显示肿瘤中有45-133个细菌肽，正常组织中有12-91个细菌肽。通过比较癌组织和正常组织的细菌肽数据，发现癌症组织和癌旁组织之间的细菌肽相似性非常低，与经典的免疫肽组明显不同，具有8个氨基酸的肽的比例较高，细菌肽的结合比例显著低于经典免疫肽。根据预测的免疫原性评分和MS/MS谱图的质量，选择了其中8种肽进行功能验证。来源于B. fragilis的B2和B5肽分别由两名患者共享。   表2. CRC新抗原鉴定   表3. CRC细菌肽鉴定   4. 使用自体的PBMC验证新抗原和细菌肽 研究人员合成了4个新抗原、3个野生型肽段和8个细菌肽段，并通过比较内源性和合成肽段的保留时间和MS/MS谱图进行验证。结果显示，3个新抗原和6个细菌肽段在内源性和合成肽段之间具有相似性。进一步的体外刺激实验表明，4个新抗原和5个细菌肽段能够激活自体T细胞，导致IFN-γ分泌。细菌肽方面，B2和B5分别由2例患者共享。B2能够激活T3的T细胞，B5能够激活T6、T8的T细胞。总之，通过蛋白质基因组学策略鉴定的候选肽中有75%具有免疫原性，可能作为抗肿瘤靶标。   图3. 鉴定的新抗原和细菌肽的免疫原性分析 5. 抗原表位TCR鉴定 在通过IFN-γ ELISpot实验确定了表位的免疫原性之后，研究发现肽段T7-N1、T8-N1和B5能激活T细胞，导致CD137表达上调。为了研究表位特异性T细胞的TCR序列，并通过单细胞TCR测序鉴定出对特定表位有反应的主导TCRαβ克隆型。研究发现，与表位共培养后，反应性T细胞的主导TCRαβ 克隆型显著扩增。通过构建慢病毒载体并转导健康供体的T细胞，成功获得了特异性识别B5肽的TCR-T细胞，并验证了其对靶细胞的特异性反应性。   图4. 抗原特异性TCR鉴定与验证 结论 本研究通过蛋白质基因组学策略全面分析了结直肠癌（CRC）患者的免疫肽组，成功鉴定出多个CRC特异性的新抗原和细菌肽，这些新抗原和细菌肽能够被患者的自体T细胞识别并引发免疫反应。研究还通过单细胞TCR测序揭示了表位反应性T细胞的TCR库，并成功构建了能够特异性识别这些表位的TCR-T细胞。这些发现不仅为CRC的个性化免疫治疗提供了新的靶点，还为开发新的免疫治疗策略，如新抗原疫苗和TCR-T细胞疗法，提供了重要的科学依据和潜在的应用方向。