免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种利用抗原抗体特异性结合原理的实验技术，用于检测组织或细胞中的特定抗原，如蛋白质。其基本原理是通过标记的抗体与组织中的抗原结合，然后通过化学反应使结合部位显色，从而在显微镜下观察到抗原的分布。这种技术不仅能够定性识别抗原，还能进行定位和相对定量分析。免疫组化实验步骤如下：

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 、组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 、无水乙醇中浸泡五分钟
c 、95%乙醇中浸泡五分钟
d、 75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

A 、抗原热修复

a 、高压热修复： 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b、 沸热修复：电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
c、 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等。　

B、 酶消化方法：

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等

免疫组化问题解答：

1、染色过强

a 、抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜；
b、 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度；
c、 DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准。

2、非特异性背景染色

a、 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟；
b、 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长；
c、 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭；
d、 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间。

3、染色弱

a 、抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟；
b、 试剂超过有效使用时间 应更换试剂；
c、 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）；
d、 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜；
e、 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟。

4、染色阴性
a 、操作步骤错误 应重试 设阳性对照；
b、 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果；
c、 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误。