分枝杆菌是一大类细菌，广泛存在于自然环境中。其中一些种类会导致人类患上严重疾病，是传染病感染中的主要死亡原因。临床上结核分枝杆菌（MTB）和牛分枝杆菌（MB）是导致人类结核病（TB）的主要原因；鸟分枝杆菌（MAV）和细胞内分枝杆菌（MI）是导致人类肺部疾病的常见原因。非结核杆菌和人类结核杆菌感染后的症状相识，极易导致误诊。所以需要准确的物种鉴养，辅助制定有效的结核病和非结合杆菌感染的治疗策略。细菌培养仍然是鉴定分支杆菌感染的金标准方法，培养周期漫长，需要约6周左右的时间。因此，需要开发精准快速的鉴定方法至关重要。
 

发表在Clinica Chimica Acta的一篇文章中通过基于RPA结合CRISPR-Cas12a的等温扩增技术，准确鉴定临床分离株中的8种分枝杆菌菌株；对各种靶向分枝杆菌的检测限为1-100拷贝/反应，特异性和灵敏度高；反应速度快，一个小时内可以获得结果；快速、便携且用户友好，非常适合资源匮乏的临床环境。

工作示意图：步骤包括（1）使用RPA反应扩增部分rpoB基因（2）用Cas12a切割靶DNA，然后反式切割荧光团-淬灭剂ssDNA-报告基因，（3）通过蓝/白光透射仪观察释放的荧光信号，肉眼可见。

材料和方法

(1)细菌菌株和临床样品的制备：提取8个参考菌株DNA 和热灭活分枝杆菌，包括结核分枝杆菌菌株 ATCC27294、牛分枝杆菌菌株 ATCC19210、脓肿分枝杆菌 ATCC19977、鸟分枝杆菌菌株 ATCC700898、偶发分枝杆菌菌株 ATCC6841、堪萨斯分枝杆菌菌株 ATCC12478、戈登分枝杆菌菌株 ATCC14470、细胞内分枝杆菌菌株 ATCC13950 和共 80 个临床分离株。小量制备试剂盒提取和纯化 DNA。

(2)靶向基因引物和gRNA设计：从ATCC和 NCBI 获得来自每个分枝杆菌物种的 rpoB 基因核苷酸序。设计靶向 rpoB 基因的 RPA 引物并进行比对。试剂盒制备gRNA。

(3)重组酶聚合酶扩增 （RPA）：使用 TwistAmp Basic 试剂盒（TwistDx，UK）。总体积为 10 μL 、含有 5.9 μL 含冻干反应的再水化缓冲液、0.48 μL 10 μM 正向和反向引物以及 2.14 μL 蒸馏水。然后，加入 1 μL 基因组 DNA 模板和 0.5 μL 280 mM MgOAC，然后在 39 °C 下孵育 30 分钟，然后在 75 °C 下热灭活 5 分钟。蒸馏水用作 NTC（无模板对照）。

(4)CRISPR-Cas12a 检测方法：1.5 μL 500 nM gRNA、0.75 μL 330 nM  SrCas12a、1 μL 6 μM 荧光团淬灭基团报告基因（FQ 报告基因）（6FAM-AGGACCCGTATTCCCA-BHQ1）、1.5 μL 10x NEBuffer 2.0 反应缓冲液和 1 μL RPA 产物。用蒸馏水将总体积调节至 15 μL。将反应物在 39 °C 下孵育 15 分钟。使用 BluPAD Dual LED 蓝/白光透射仪 （BIO-HELIX，台湾） 观察荧光信号。使用智能手机相机捕获荧光读数，并使用 ImageJ（NIH，美国）自动调整。对于荧光定量，通过 Applied Biosystems™ QuantStudio™ qPCR Systems（Thermo Fisher Scientific，美国）测量荧光。每个实验重复 3 次。

(5)评估特异性并确定参考菌株的检测限:通过对 7 种分枝杆菌属的交叉反应性测试来评估 gRNA 的特异性。检测限 （LOD） 一式三份，将每个标准 DNA 靶标从 10 个靶标中连续稀释 10 倍5拷贝数/μL 低至 1 拷贝/μL 作为 MyTRACK 检测的模板。通过检测基因组 DNA 浓度最低的试管中的荧光信号来确定 LOD。对各种靶向分枝杆菌的检测限为 1 - 100 拷贝/反应。


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